皆さんはDNAマイクロアレイ法について説明できますか？また、実際にDNAマイクロアレイを使った解析ができますか？
「DNAマイクロアレイ法は講義で学んだが、よく理解できなかった」「実際に測定したことがなく、原理をイメージしにくい」「卒業研究でDNAマイクロアレイ法が必要なので復習したい」「研究以外でどのように利用されているか興味がある」
今回はこのような悩みを持つ学生の方に向けて、DNAマイクロアレイ法の原理、メリットとデメリット、活用方法をまとめました。また、DNAマイクロアレイ法の医療現場での活用についても紹介します。
DNAマイクロアレイ法の目的
DNAマイクロアレイ（DNA microarray）は、別名DNAチップとも呼び、最大数万種類のDNA断片（DNAプローブ）を、プラスチックまたはガラス製の基盤上に高密度に並べた器具の名称です。DNAマイクロアレイ法は、このDNAマイクロアレイを用いて、組織や細胞の遺伝子発現（DNAやmRNA）を網羅的に解析する方法です。
DNAマイクロアレイ法の原理
まず、サンプルから抽出したmRNAを鋳型に、逆転写酵素を用いて相補的DNA（cDNA）を合成します。cDNAは、DNAマイクロアレイ上にあるDNAプローブの相補的な配列と結合（ハイブリダイゼーション）します。最後にDNAマイクロアレイのハイブリダイゼーションした部分を検出することで、サンプルにどのmRNAがどれくらい発現しているか解析します。また、DNAを制限酵素で切断し、DNAマイクロアレイ上のDNAプローブとハイブリダイゼーションさせることで直接DNAを網羅的に解析することも可能です。
DNAマイクロアレイの種類
DNAマイクロアレイは、作成方法で2種類に分けられます。一つはアフィメトリクス社のGeneChip®で、もう一つがスタンフォード社のcDNAマイクロアレイです。
アフィメトリクス社のGeneChip®
GeneChip®はon chip合成型（別名：アフィメトリクス型）で作成します。その方法は、数十万個のDNAプローブを基板上で人工的に合成するものです。GeneChip®のDNAマイクロアレイは一本鎖のDNAで構成されており、プローブとする塩基配列の情報が必要です。また、単位面積あたりのDNAプローブ数は高密度で作成できます。
スタンフォード社のcDNAマイクロアレイ
cDNAマイクロアレイは、あらかじめ合成したcDNA断片を、基盤となるガラス上に固定するスポッティング型（別名：スタンフォード型）で作成します。細胞や組織から抽出したmRNAをもとにすることができるため、必ずしも全塩基配列の情報は必要ありません。しかし、単位面積あたりのDNAプローブ数はアフィメトリクス型と比較すると少なくなります。
DNAマイクロアレイ法の検出方法
DNAマイクロアレイ法では、基盤に固定されたDNAプローブとcDNAとのハイブリダイゼーションを検出することで、遺伝子発現を解析します。今回は、ハイブリダイゼーションを検出する代表的な方法を2つ紹介します。
蛍光強度を用いた方法
サンプルから抽出したmRNAからcDNAに逆転写する際、Cy3（緑色）またはCy5（赤色）などで標識されたdUTPを混ぜることで、cDNAを蛍光標識します。cDNAがハイブリダイゼーションした部分は、蛍光を発します。その蛍光強度を検出することで、遺伝子発現を定量することができるのです。また、別の蛍光色素で標識した2種類のサンプルcDNAがDNAプローブと競合的にハイブリダイゼーションすることで、サンプル間の遺伝子発現の有無や発現量の違いを検出できます。
電流強度を用いた解析
この方法で用いるDNAマイクロアレイの基盤上のDNAプローブが固定されている部分には、金電極がついています。DNAプローブとcDNAがハイブリダイゼーションして2本鎖になり、その間に挿入剤（Hoechst®33258）が入ると、電流が発生します。この電流を検出することでmRNA発現を解析します。この技術は東芝が確立し、蛍光強度による方法と比較して試薬や機器が安価であり、機器の小型化できる点が優れています。そのため、医療現場での迅速診断に利用されています。
DNAマイクロアレイ法のメリットとデメリット
mRNAの定量は、DNAマイクロアレイ法以外にもいくつかの方法があります。ここでは、一般的に広く用いられているノーザンブロッティングやリアルタイムPCR、そして同じく網羅的な解析が可能なRNAシーケンス（RNA-seq）と比較したときのメリットとデメリットについて解説します。
ノーザンブロッティング・リアルタイムPCRとの比較
ノーザンブロッティング・リアルタイムPCRとDNAマイクロアレイ法と比較したときの、メリット・デメリットは以下の通りです。
ノーザンブロッティング、リアルタイムPCRとの比較したメリット
遺伝子発現の網羅的解析が可能
ノーザンブロッティングやリアルタイムPCRでは原則、ターゲットにした特定のmRNAしか解析できません。一方でDNAマイクロアレイ法では、サンプルの遺伝子情報を網羅的に解析できます。網羅的な解析では、全く新しい知見を得ることも可能です。これはDNAマイクロアレイ法の最大のメリットです。
サンプル間の遺伝子発現を網羅的に比較可能
2つのサンプルでの遺伝子発現を比較することは、ノーザンブロッティングやリアルタイムPCRでも可能です。しかしDNAマイクロアレイ法では、2つのサンプルの遺伝子発現の網羅的な比較が一度の測定で可能です。具体的な方法を説明します。例えばサンプルAとサンプルBから抽出したRNAからcDNAを合成する際、それぞれ異なる蛍光色素で標識します。そして、同じDNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせます。2種類の蛍光強度を測定し、それぞれの蛍光の強度により、比較ができます。例えば、サンプルAの蛍光の方が強く検出された場合、その遺伝子はサンプルAのみに発現していることがわかります。両方の蛍光が同程度検出された場合、その遺伝子はサンプルA・Bともに同じくらい発現していることがわかります。
ノーザンブロッティング、リアルタイムPCRとの比較したデメリット
定量性が低い
DNAマイクロアレイ法では、特に発現量が低い遺伝子を正確に定量することは難しいです。サンプルcDNAの中には、完全に配列が一致しているわけではないDNAプローブと偶然ハイブリダイゼーションするものもあります。そのためデータ解析の際は、一定よりも低いシグナルを無視することが一般的です。その結果、微量な発現の遺伝子はデータを得ることが困難です。
偽陽性が多い
偽陽性とは、本当は遺伝子発現していない（陰性である）にも関わらず、遺伝子発現している（陽性である）と判断されてしまうことです。DNAマイクロアレイ法では、アレイ上のDNAプローブとサンプルcDNAがハイブリダイゼーションしているところが、陽性として検出されます。しかし先述の通り、配列が完全に一致していない場合でもハイブリダイゼーションしてしまうことがあります。それにより、実際よりも高い発現量という結果になってしまう、つまり偽陽性になってしまうのです。
測定コストが高い
DNAマイクロアレイ法では、DNAマイクロアレイの他にも、専用の検出機器、結果を解析するためのソフトなどが必要になります。これらの費用はノーザンブロッティングやリアルタイムPCRと比較して高額になります。
RNA-seqとの比較
次は、RNA-seqと比較したときの、DNAマイクロアレイ法のメリット・デメリットを紹介します。RNA-seqとは、断片化したmRNAの配列を次世代シーケンサーを用いて解読し、解析することで、mRNAの発現量を測定する方法です。
RNA-seqと比較したメリット
解析データサイズが小さい
RNA-seqでは、1回の解析で数千万〜数億本のmRNA断片の配列を決定し、遺伝子発現の網羅的な解析を行います。そのため、データサイズがギガバイトの単位にもなります。一方、DNAマイクロアレイ法で扱うデータサイズはメガバイト単位と、RNA-seqの1/1,000程度です。そのため、データの保管や解析は、普段使っているPCでも可能です。データサイズが小さい分、RNA-seqよりも解析にかかる費用も安く抑えることもできます。
解析にかかる時間が短い
前項で紹介した通り、DNAマイクロアレイ法では扱うデータサイズがRNA-seqと比較して小さいです。そのため、解析ソフトによっては数分で解析が可能です。一方、RNA-seqでは解析に数週間かかる場合もあります。
RNA-seqと比較したデメリット
既知の遺伝子しか検出できない
DNAマイクロアレイ法での遺伝子発現の定量には、DNAマイクロアレイが必要です。DNAマイクロアレイの基盤上のDNAプローブを作成するためには、塩基配列が既知である必要があります。一方RNA-seqでは、mRNAの配列を決定していくことで、発現解析を行います。そのためRNA-seqでは、塩基配列が未知の遺伝子の発現も検出が可能です。
発現量の少ないmRNAの検索性能が劣る
先述の通り、DNAマイクロアレイ法では発現量の低いmRNAの定量は困難です。一方RNA-seqでは、原理的に細胞内すべてのmRNAを検出することもできるため、発現量の低いmRNAの網羅的な検索も可能です。
ノーザンブロッティングやリアルタイムPCRは、特定の遺伝子の発現量を定量する実験です。一方、DNAマイクロアレイやRNA-seqは遺伝子発現を網羅的に解析できることができます。また、測定したい遺伝子によってはRNA-seqではオーバースペックとなります。それぞれの方法の利点・欠点から、自分の求めるデータがDNAマイクロアレイでの解析が適切かを確認することが大切です。
DNAマイクロアレイの活用方法
ここからはDNAマイクロアレイ法の活用方法を4種類紹介します。
- 遺伝子発現の定量
- SNP解析
- コピー数多型解析
- 塩基配列解析
いずれも、他にも遺伝子解析の方法はあります。しかし、DNAマイクロアレイ法ではそれらを網羅的に測定できるため、そのメリットを活かした目的であることを確認して研究計画を立てましょう。
遺伝子発現の定量
DNAマイクロアレイ法では検出強度から遺伝子発現を定量できます。1つのエリアに複数本同じDNAプローブが並んでいるため、例えば、10本のDNAプローブ中3本でハイブリダイゼーションした場合と、10本中9本でハイブリダイゼーションした場合では、検出強度は3倍になります。
一塩基多型の測定
一塩基多型（SNP）は個体間で認められる遺伝子の差異の一種です。遺伝子配列のうち一つの塩基が別の塩基に置換されていることがあります。SNPにより合成されるタンパク質の質的、量的な変化が生じて個体差が生じます。
DNAマイクロアレイ法でのSNPの検出方法を解説します。初めに、PCR法等でDNAを増幅させます。次に制限酵素でDNAを切断し、DNAマイクロアレイに加えます。この時に使用するDNAマイクロアレイには特定のSNPの前までハイブリダイゼーションできる塩基配列を有しており、DNAマイクロアレイ上にDNA鎖を固定します。最後に蛍光標識した塩基をDNAマイクロアレイに加えることで、対応する塩基が結合します。その結果、SNPにより結合する塩基の種類が異なり、異なる蛍光が測定されます。この工程を一枚のDNAマイクロアレイで数万パターンの測定を行い一度の測定で複数の遺伝子のSNPを解析します。
また、既知のSNPに対してはSNPに相補的なDNAプローブを含むDNAマイクロアレイを用いることで、網羅的にSNPの検索が可能です。
コピー数多型解析
コピー数多型は同じ遺伝子の数の個体差を指す遺伝子多型の一種です。通常は1つの細胞には遺伝子は2個（2コピー）あります（染色体が2本あるため）。しかし、コピー数多型では1つの細胞に1コピーしかない（欠失）または3コピー以上存在する（重複）ことがあります。コピー数の違いは先天性の疾患の原因以外に疾患感受性や薬物感受性に関わると考えられています。
DNAマイクロアレイ法によるコピー数多型の解析方法を紹介します。まず標準となる遺伝子サンプル（レファレンスサンプル）と測定したい検体サンプル（テストサンプル）を準備します。次に制限酵素でDNAを切断し、それぞれ別の蛍光色素で標識します（レファレンスサンプルを緑、テストサンプルを赤と仮定）。それらを同じDNAマイクロアレイに加えて蛍光を測定します。赤と緑の蛍光が同じ場合テストサンプルではコピー数多型はない、緑の蛍光が強い場合テストサンプルでは欠失がある、赤の蛍光が強い場合テストサンプルでは重複があるとなります。
塩基配列解析
DNAの塩基配列を決定する方法ではサンガー法が有名です。しかし、DNAマイクロアレイ法でも遺伝子の塩基配列を特定することはできます。一定の長さの塩基配列のDNAプローブを配置したDNAマイクロアレイを用意します。次に、蛍光標識したサンプルのDNAを加え、ハイブリダイゼーションさせます。この時、ハイブリダイゼーションした塩基配列をサンプルは有していることになります。この作業を何度も繰り返すことで最終的に塩基配列を明らかにすることが可能です。一方で欠点もあります。例えば5塩基でDNAプローブを作成すると45＝1024通りのDNAプローブが必要です。そのため、1つのサンプルの塩基配列を測定するのに膨大な組み合わせを検討することもあります。
DNAマイクロアレイ法の研究以外での利用
ここまでDNAマイクロアレイ法の原理や実験での活用方法について紹介しました。ここからは、実際にDNAマイクロアレイの技術が世の中でどのように役立てられているか、医療分野での実用例を紹介します。
- 先天性疾患の網羅的な遺伝子検査
- 血液のみでのがん検診
- 患者さんに合わせたがん治療を目指した研究
先天性疾患の網羅的な遺伝子検査
ここではコピー数多型を検出することで、染色体異常による、小児の発達遅滞、知的障害、先天異常症に関する検査を一度に行うことができます。これまでの方法では、検出率が低く、追加検査や確定診断にも時間がかかる点で課題がありました。しかし、DNAマイクロアレイ法を用いることで、59種類の疾患に対する遺伝子検査を一度に行うことができ、診断にかかる時間が短くなり、治療法の選択や合併症への予防措置を始めるまでの時間の短縮に繋がることが期待されます。この方法は、2021年10月より保険適応になりました。
血液のみでのがん検診
この方法は保険適応外（費用は1回7万円前後）ですが5mlの血液サンプルから胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆道癌を調べることができます。健康な人と癌を発症した人では血液中の遺伝子発現には違いがあります。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて、検査希望者の遺伝子発現を解析することで、そのパターンが健康な人と癌患者さんのどちらに近いか確認し、癌の発生を解析します。この方法では4つの臓器についてはどこの臓器のがんかまで検出できるので、その後精密検査をすることで早期発見、早期治療に繋がります。
患者さんに合わせたがん治療を目指した研究
同じ臓器のがん細胞でも実は遺伝子レベルでは違いがあります。特定の抗がん剤が有効となる遺伝子変異を持っていたり、逆に抗がん剤に対して耐性化しやすい特徴を有していたり様々な個性があります。そこで、がん細胞の遺伝子発現をDNAマイクロアレイ法で解析することで、有効となりやすい抗がん剤の選択や逆に耐性化しやすい抗がん剤は使用しない等、患者さんごとの治療戦略が立てられないか、現在も研究が行われています。
まとめ
今回の記事ではDNAマイクロアレイ法について紹介しました。
組織や細胞の遺伝子発現を網羅的に解析する
サンプルから抽出したmRNAを鋳型にcDNAを合成し、DNAマイクロアレイに加える。マイクロアレイ上のDNAプローブとのハイブリダイゼーションを検出することで、遺伝子発現を網羅的に解析することができる。
ノーザンブロッティングやリアルタイムPCRと比較したメリットとデメリット
RNA-seqと比較したメリットとデメリット
DNAマイクロアレイの活用方法
- 遺伝子発現の定量
- SNP解析
- コピー数多型解析
- 塩基配列解析
- 先天性疾患の網羅的な遺伝子検査
- 血液のみでのがん検診
- 患者さんに合わせたがん治療を目指した研究
今回はmRNAの定量方法の一つである、DNAマイクロアレイ法について解説しました。DNAマイクロアレイ法以外のmRNAを定量する手法は、下記記事で紹介しています。
